Metabolismo de las Bacterias sulfatorreductoras y Métodos de Cultivo

Estos organismos anaeróbicos realiza procesos de respiración de sulfatorreducción, en el cual el sulfato actúa como un terminal aceptor de electrónes (en lugar de oxígeno en las formas de vida aeróbicas), por su proceso respiratorio. Se ha declarado que la reducción del sulfato es uno de los procesos microbiológicos más comunes que ocurren en todo el mundo.

El proceso metabólico de la reducción del sulfato realizado por la célula, es solo conocido parcialmente. Los pasos iniciales pueden ser representados así:

1.    SO₄^-2 + ATP --> APS + PP

2.    PP + H₂O --> 2P

3.    APS + 2e --> AMP + SO₃^-2

El sulfato activado por el ATP (Adenosin trifosfato, un compuesto energético descubierto en todos los organismos terrestres),para formar un diferente nucleótido, adenosin-5-fosfosulfato (APS). La enzima que activa esta reacción es el ATP-sulfurilasa. Otra enzima, la pirofosfatasa, remueve el pirofosfato (PP), hidrolizando  al ortofosfato, esto hace que el equilibrio de la reacción vaya a la derecha. El APS es luego reducido por la enzima APS- reductasa mas electrones de hidrógeno ( vía una hidrogenasa), para formar sulfito y AMP (Adenosim monofosfato).

Los pasos de reducción del sulfito sonngeneralmente desconocidos. Un disulfuro de oxígeno ha sido identificado como un producto gaseoso relativamente estable(en ausencia de aire y humedad) del Desulfovibrio, tal vez es producido de la casi inmediata descomposición del SO:

3SO --> S₂O +SO²

Se podría concebr que el SO es un producto intermedio en la reducción del SO₃^-2 , asumiendo que el azufre reduce ds electrones por cada paso:

SO₄⁽⁺⁶⁾ --> SO₃⁽⁺⁴⁾ --> SO⁽⁺²⁾

Pruebas para su determinación

Las bacterias sulfatorreductoras se encuentran entre los microorganismos mas destructivos, y su impacto ambiental es muy amplio. Ellas causan corrosión y agrietamiento por corrosión y fatiga ( stress corrosión cracking) de metales y aleaciones, usado en refinería e industria del petróleo, sistemas de enfriamiento, sistema de tratamiento de residuales, producción de pulpa y papel y en todos los procesos acuosos.

En 1910 se reconoció que la BSR son las responsables de las picaduras en tuberías enterradas. Las BSR producen sulfuro de hidrógeno que son letales que el cianuro de hidrógeno. Algunas veces el sulfuro es usado por otros organismos para obtener ácido sulfúrico, el cual destruye rápidamente las redes de concreto de las aguas municipales. El agotamiento del oxígeno y la existencia de sulfuro de hidrógeno suprime la vida marina en las áreas infestadas con estas bacterias que suelen establecerse en las profundidades.

Los sintomas de los problemas relacionados con BSR son:

• Olor de Sulfuro de hidrógeno
• Ennegrecimiento de las aguas
• Productos de corrosión sulfurosos de color negro

Normalmente un tratamiento efectivo es mucho mas fácil llevarlo a cabo si la infestión es detectada en un estado inicial (temprano).

Anteriormente, los ensayos microbiológicos para BSR estaban limitados a cultivar la muestra de laboratorio hasta que el número de BSR fuera lo suficientemente alto para ser detectados por métodos comunes, tales como la observación del ennegrecimiento general de la muestra. Sin embargo, tales métodos tienen serias limitaciones, partiendo del hecho de que las BSR, no esta representada por una sola especie sino que incluye una colección de diferentes tipos de organismos.

Los tipos de BSR conocidos actualmente tienen diferentes requerimientos con respecto a los nutrientes y la temperatura. Por esta razón, ensayos para evaluar BSR en el crecimiento sobre un medio en particular o a una temperatura será siempre selectiva para ciertas especies.

Métodos de cultivo

Botellas de Cultivo API RP-38

Desarrolado por American Petroleum Institute descrita en su practica recomendada N° 38 ( Técnicas Alternativas para la estimación de Bacterias Sulfato Reductoras), este método usa un medio basado en Lactato de Sodio. Cuando las bacterias Sulfato Reductoras están presentes en la muestra, ellas reducen el sulfato en el medio a sulfuro, el cual reacciona con el fierro en la solución para producir sulfuro negro de fierro. El ennegrecimiento del medio después de un periodo de 28 días, es señal de la presencia de Bacterias Sulfato Reductoras.

El procedimiento consiste en inyectar 1ml. De muestra dentro de una botella conteniendo 9 ml. De liquido medio de cultivo. La botella es después agitada vigorosamente, y se usa un nueva jeringa para extraer 1 ml. De muestra e inyectarla dentro de un nuevo medio de cultivo. Este procedimiento es repetitivo para producir tantas disoluciones como son repetidas. RP-38 especifica una serie de  5, pero pueden ser necesaria 10 ó 12 botellas, cuando los conteos son muy altos.

La interpretación más simple de los resultados de la prueba, es considerar ue una botella ennegrece, la muestra contiene al menos 1 col/ml, si dos lo hacen, la muestra contiene al menos 10 col/ml; 3 botellas ennegrecidas, significan 100 col/ml; y así sucesivamente.

Usualmente los resultados son reportados como rangos, por ejemplo si 4 botellas ennegrecen, puede einterpretarse como 10³ a 10⁴ colonias/ml. en la muestra original. Si el simbolo mayor (>) o (>=) aparece, significará que todas las botellas de las serie se tornaron negras. En ocasiones, una botella de la serie, puede permanecer clara, mientras que botellas de mayor y menor dilución ennegrecieron. Cuando esto sucede los resultados son interpretados como si la botella que permaneció clara hubiese también ennegrecido, esto es, la última botella en la serie que realmente se torna negra, determina el resultado de la prueba.

Agar Deeps

Desarrollado por laboratorios Biosan (USA). El medio es una ligera modificación del medio RP-38, con sulfito de sodio que actúa como secuestrante de oxígeno. Como con las botellas RP-38, el ennegrecimiento del medio indica prueba positiva de bacterias sulfato reductoras. El contenido de bacterias es estimado en este caso por lña rapidez del ennegrecimiento.

El medio es inoculado utilizando un limpiador de tubos dentro de una muestra sin diliuir e insertando esta a un vial de agar semisólido. Se añade entonces, aceite mineral y tabletas generadoras de CO₂ para excluir el aire, y el vial es tapado e incubado por 5 días, chequeando diariamente el ennnegrecimiento.

Tubos de Agar Disuelto

Este método desarrollado por la Nalco Chemical Co. emplea tryptona como el único nutriente. Como en el Agar Deeps. Esta contiene sulfito de sodio como secuestrante de oxígeno.

El procedimiento de la prueba involucra poner tubos en agua caliente para licuar el medio y después enfriarlos hasta que el medio alcance una temperatura de 40 a 45°C antes de añadir la muestra. Pueden ser hechas disoluciones de hasta 10⁶. Los tubos son tapados y puestos para incubación por 3 días. Los resultados son interpretados por multiplicación del número contabilizado de colonias por el factor de dilución, para estimar el número de colonias por ml de muestra.

En teoría, si uno o más tubos muestran ennegrecimiento general, entonces un siguiente número podría tener un número contable de colonias discretas. Donde este no fuera el caso, el último tubo ennegrecido debe considerarse como >100 colonias. Por ejemplo, si una serie de 4 tubos es inoculada y los dos primeros, se toman negros pero los otros dos, no tienen colonias visibles, el resultado debe ser reportado como >10³ col/ml.

Métodos Directos

Los métodos directos no requieren crecimiento de Bacterias Sulfato Reductoras durante la prueba. Sin embargo, pueden medir directamente las BSR.

1.   Ensayo ATP

Este método estima el número total de organismos, midiendo la cantidad de Adenosin trifosfato (ATP) en una muestra. ATP es un compuesto encontrado en toda materia viviente. Esta técnica puede ser usada con muestras de agua del área de petróleo para estimar el número relativo de organismos presentes, incluyendo las BSR. El procedimiento requiere filtrar la muestra para remover los sólidos disueltos y sales que pueden interferir con la prueba. Esta muestra filtrada, es añadida a un reactivo que resalta las células ATP. Se añade una enzima especial que reacciona con ATP para ocasionar una reacción química fotoquímica, y el resultado es una luz estimada por un fotómetro. El Número de celdas de bacterias es estimado por el número total de luces contadas.

2.   Epifluorescencia / Celdas Anticuerpos Superficiales

Conocido como método ECSA, está basado en la adhesión de anticuerpos específicos a las Bacterias Sulfato Reductoras. Los anticuerpos, identificados con un cuerpo fluorescente, adhieren solo a sitios específicos sobre la superficie de las BSR; cuando es visto bajo un microscopio epifluorescente, un anticuerpo unido a una celda es identificado por un color fluorescente.

El procedimiento requiere calentar la muestra en una placa especial e incubarla por 20 minutos con un primer agente anticuerpo primario.  Después la muestra es lavada para remover el exceso de anticuerpo, y es incubada por 20 minutos con un segundo agente anticuerpo conteniendo el agente fluorescente. Entonces, la muestra es relavada y se añade un fluido especial. El conteo es hecho a 1000 x aumento dentro del aceite de inmersión.

3.   Anticuerpos APS Reductasa

Conocido como método ARA, fue desarrollado por Du Pont Co. Involucra anticuerpos desarrollados frente a fosfosulfato-5-adenosina (APS) reductasa, una enzima interna encontrada en todas las BSR. La muestra es primero lavada para remover interferencias químicas como sulfuro de hidrógeno. Luego es tratada ultrasónicamente con una batería de poder, que rompe la célula de la bacteria y libera la enzima APS Reductasa.

El resto de la prueba tiene lugar dentro de la pipeta de transferencia de polietileno. La muestra es pasada de la pipeta a un glóbulo poroso. Esto es lavado 4 veces. Si la enzima APS reductasa esta presente en la muestra (indicando la presencia de BSR), el glóbulo se torna azul dentro de 10 minutos. El grado de coloración, es proporcional a la cantidad de enzima en la muestra, y los resultados son leídos en una carta de colores proporcionada con el kit. La carta correlaciona el color obtenido con el número aproximado de BSR presente.

Comparación de los Métodos señalados

En principio ningún método es superior a otro en todos los aspectos. Por esta razón se sugiere el uso de los métodos mencionados en combinación para obtener mejores resultados.

Los métodos de cultivo, en general, son capaces de detectar cantidades mas pequeñas de BSR que los métodos directos, aunque ellos son en cierto modo para determinadas especies.

Las botellas con el caldo de cultivo API RP-38 parecen ofrecer la mejor combinación de sensibilidad y exactitud cuando se trabaja con organismos que consumen lactato tales como la Desulfovibrio desulfuricans. La mejor práctica para resultados precisos es permitir 28 días de incubación (como lo específica la norma) en lugar de 14 a 21 días que es la práctica común.

El método de más fácil aplicación en campo, entre los métodos de cultivo es el Agar Deeps, además ofrece resultados en menos tiempo que el método API RP-38. Pero, frecuentemente, no correlacionan bien con otros métodos y suele dar falsa respuestas positivas con las BSR. Por etas razones. El uso del Agar Deeps es recomendado únicamente si este método es validado con los resultados obtenidos con el método API RP-38.

Los tubos de agar disuelto parecen insensibles a cantidades pequeñas y grandes de BSR. Esta característica, unido a su tendencia a dar falsas respuestas positivas en la presencia de reductores de sulfato que no son BSR, nos indica una pobre utilidad para monitorear BSR.

Los resultados de los ensayos ATP no correlacionan bien con las BSR, se obtienen valores elevados en muestras de campo y valores inferiores en muestras puras de BSR. Por lo que los ensayos ATP son probablemente útiles únicamente en casos donde se desea un conteo total bacterial.

La técnica ECSA parecer ser un método valido para la detección de BSR en muestras de campo, pero para obtener resultados precisos se requiere contar con personal altamente entrenado. Su límite más bajo de detección en muestras de campo es aproximadamente 104 colonias/ml.

El método ECSA no es válido para detectar especies de laboratorio de BSR y es inapropiado para evaluar muestras de campo con grande cantidades de sólidos suspendidos. El método ARA es el más rápido y la única verdadera técnica de campo. Los resultados obtenidos con este método son generalmente comparables con los obtenidos por el medio API RP-38, sin embargo este método tiene un límite de detección de cerca de 10³ colonias/ml.